食品微生物檢驗

食品中微生物的檢驗

一、概念和分類

微生物并不是生物學分類學上的專門名詞，而是對所有形體微小，單細胞的或個體結構較為簡單的多細胞的、甚至沒有細胞結構的低等生物的統稱。

微生物群體非常龐雜，種類繁多，包括細胞型和非細胞型兩類。凡具有細胞形態的微生物稱為細胞型微生物。細胞型微生物按細胞結構又分為原核微生物和真核微生物。

原核生物的主要特點：細胞內有明顯的核區，但沒有核膜包圍；核區內含有一條雙鏈DNA構成的染色體；能量代謝和很多合成代謝均在質膜上進行，核糖體分布在細胞之中；相對于原核微生物，真核微生物的細胞結構有了真正的細胞核,有多種細胞器；而病毒則不具有細胞結構，由核酸和蛋白質組成，可以認為是超顯微的、沒有細胞結構的、專性活細胞內寄生的實體。它們在活細胞外具有一般化學大分子的特征，在宿主細胞內又具有生命特征?？梢宰鳛榱私獾氖牵《究梢酝ㄟ^細菌濾器，且對***不敏感，對干擾素敏感。

二、細菌、霉菌、酵母菌和致病菌介紹

細菌的細胞結構在原核生物中具有代表性，主要由細胞壁、細胞膜、細胞質、核質體等部分構成,有的細菌還有夾膜、鞭毛、菌毛等特殊結構。在自然界中細菌是分布*廣、數量*多的一類生物，并與食品關系*為密切。是食品理論、工業發酵和釀造研究的主要對象，也是導致食品腐敗的主要類群。細菌的基本形態有球狀、桿狀和螺旋狀,分別被稱為球菌、桿菌和螺旋菌。

霉菌是一些絲狀**的統稱。在自然界分布極廣，它的營養來源主要是糖類和少量氮、礦物鹽等，極易在含糖的食品、餅干、面包和各種谷物、水果上生長。經常會有食品會因為發生霉變而不能食用，還有些霉菌會產生毒性很大的**，比如黃曲霉素、黃米**、雜色曲霉素和展青霉素等等，都可能導致癌癥，這類霉菌在大米和花生中*多。由此，對霉菌的檢測尤為重要。霉菌菌體是由分支或不分支的菌絲組成，菌絲細胞均由細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核、線粒體、核糖體以及內含物組成。在固體培養基上，部分菌絲深入培養基內吸收養料，稱為營養菌絲；另一部分則向空氣生長，稱為氣生菌絲；有的氣生菌絲發育到一定階段分化為繁殖菌絲。霉菌的菌落一般比細菌菌落大幾倍到幾十倍，同一種霉菌，在不同成分的培養基上形成的菌落特征可能有變化，但各種霉菌，在一定的培養基上形成的菌落大小、形狀、顏色等卻相對穩定。菌落特征也是鑒定霉菌的重要依據之一。

酵母菌多數為單細胞，一般呈圓形、橢圓形、圓柱形或檸檬形，也有些酵母菌細胞與其子代細胞連在一起成為鏈狀，形成假菌絲，稱為假絲酵母。酵母菌在適宜的培養基上形成的菌落與細菌相似，但比細菌菌落大而且厚，菌落表面濕潤、粘稠、易被調起，有些種因培養時間太長使菌落表面皺縮。

三、培養基（北京陸橋）

1、微生物的營養

微生物同其他生物一樣，需要不斷地從外部環境中獲取營養，才能夠維持生命。微生物細胞主要有水、有機物和無機鹽等化學成份組成，不同的微生物種類其細胞的化學組成也不相同，而且含量也有差異。因此，維持微生物生長所需要的化學元素的種類與含量也不相同。一般來說細胞含有某種元素的量高則細胞對這種元素的需要量也就大，含量低則需要量也小。這也是為什么我們不同的微生物培養要選擇不同的培養基。另外，同一種微生物在不同的培養基上的菌落形態也有差別，所以在選擇培養基是要注意。

微生物所需要的營養物質按照它們在機體中的生理作用不同，可以分為碳源、氮源、無機鹽和生長因子四種類型。能被微生物用來構成細胞物質的或代謝產物中碳（氮）素來源的營養物質稱為碳（氮）原物質；無機鹽為微生物機體提供金屬元素；有些微生物在含有氮源、碳源、無機鹽的培養基上人不能生長，而需要添加某些生長因子，滿足生長的需要，比如維生素、氨基酸、嘌呤堿基等。我們經常用到營養物質：單糖、淀粉等（碳源）；尿素、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏等（氮源）；硫酸鋅等（無機鹽）。

2、培養基配制

培養基是人工配制的合適于不同微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養基質，是進行微生物培養的基礎。配制培養基需要遵循一定的原則：

**，根據不同微生物的營養需要配制不同的培養基；

自養型微生物合成能力強，可以利用簡單的無機物質合成復雜的細胞物質，其培養基可以由簡單的無機物質組成。而異樣型微生物合成能力差，不能以無機物質作為**營養源，就要在培養基中添加一些有機物質（比如葡萄糖等）。另外細菌和酵母菌對培養基的要求也不同，細菌一般用牛肉膏蛋白胨培養基培養，而酵母菌則用麥芽汁培養基培養。

**，注意各種營養物質的濃度和配比；

微生物生長所需要的營養物往往是在濃度合適的條件下才表現出良好的作用，濃度大時反而對微生物生長期抑制作用。微生物只有在適合生長的條件下，才表現出應有的形態特征，而不適合的條件下生長，會是微生物的形態特征發生改變。

第三，將培養基的pH控制在一定的范圍之內，滿足不同類型微生物的生長繁殖或積累代謝產物。

各種微生物生長的*適pH各不相同，一般來說，細菌生長的pH在中性和微堿性之間（pH在7-7.5），酵母菌和霉菌生長的pH值通常是偏酸的（pH在4.5-6）。另外由于微生物在生長和代謝過程中，由于營養物質的利用和代謝產物的形成與積累，會改變培養基的pH值，如果不及時控制，往往會導致生長停止。因此，為了維持培養基pH的相對恒定，通常在培養基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽。

3、培養基的類型及應用

培養基的種類很多，按培養基組成物質的化學成分分為合成培養基和天然培養基；根據物理狀態不同分為固體培養基、半固體培養基和液體培養基（常用凝固劑有瓊脂、明膠和硅膠，硅膠是由無幾的硅酸鈉和硅酸鉀被鹽酸及硫酸中和時凝聚而成的膠體，不含有機物，因而適合于用來分離和培養自養型微生物）；根據培養基的特殊用途，可將培養基分成基礎培養基、加富培養基、選擇培養基、鑒別培養基等。

基礎培養基：含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養物質的培養基。牛肉膏蛋白胨培養基是*常用的基礎培養基；

加富培養基：在普通培養基上加入其他營養物質，用以培養某種或某類營養要求苛刻的一樣微生物；

選擇培養基：根據某種或某一類微生物的特殊營養需求或對某種化合物的敏感性不同而設計出來的一類培養基。利用這種培養基可以將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。比如，我們在培養基中加入青霉素或者四環素等***（生長抑制劑，抑制細菌和放線菌生長），可以分離酵母菌和霉菌；通過在培養基中加入結晶紫或提高培養基中氯化鈉的濃度（7.5%），可以從混雜的微生物群體中分別分離出革蘭氏陰性菌或葡萄球菌；加孔雀石綠可以分離出革蘭氏陽性菌。

鑒別培養基：在普通培養基內加入某種試劑或化學藥品，使得某種微生物在這個培養基上生長后，可以產生某種代謝產物，這種代謝產物可以與培養基中的特定試劑或化學藥品起反應，產生某種明顯的特征性變化。根據這種特點來區分微生物。比如：大腸菌群測定中，液體培養基中加入溴甲酚紫和發酵管，來指示微生物生長過程中是否產酸產氣；伊紅美藍培養基是一種鑒別培養基，常用于檢查乳制品和飲用水中是否含有致病性的腸道細菌，伊紅為酸性染料，美藍則為堿性染料。當大腸桿菌發酵乳糖產生混合酸時，與伊紅染色，再與美藍結合生成紫黑色化合物。在此培養基上生長的大腸桿菌形成呈紫黑色帶金屬光澤的小菌落。而產氣桿菌則形成呈棕色的大菌落。不能發酵乳糖的細菌產堿性物較多，帶負電荷，與美藍結合，被染成藍色菌落。還可以加入明膠，看液化明膠的情況。

四、微生物檢驗

食品中的微生物檢驗項目主要有四個：菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母菌、致病菌。其中致病菌又主要包括沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌。

首先，我們看一下菌落總數的測定。我們先弄清楚幾個概念什么是菌落、菌落總數和細菌總數？我們都知道單個細菌用肉眼是看不見的，但是，當單個或少數細菌在固體培養基上大量繁殖時，便會形成一個肉眼可見的，具有一定形態結構的子細胞群體，這就是菌落。而菌落總數就是指食品經過檢樣處理，在一定條件下進行培養后（如培養基成分、培養溫度和時間、PH、需氧性質等），所得1mL（g）檢樣中所含菌落的總數。更確切地說即在需氧情況下，36℃±1℃培養48h，能在普通營養瓊脂平板上生長的菌落總數，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養要求的以及非嗜中溫的細菌，由于現有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。因此菌落總數并不表示實際中的所有細菌總數，菌落總數并不能區分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數，需氧菌數等?？梢姲丫淇倲稻偷韧诩毦倲凳遣淮_切的。我們可以看看長在營養瓊脂平板上*常見的菌落形態，當然并不是所有的菌落都會長的這么規則，而且也不是所有的菌落都會長的這么大，像葡萄酒、水這樣的樣品長出的菌落就會很小。這就需要我們借助放大鏡來觀察，防止漏數菌落數。弄清這幾個概念后，我們就來看一下菌落總數測定的具體操作步驟：

（1）以無菌操作，將檢樣25g(25ml)剪碎放于含有225ml，**生理鹽水或其他稀釋液的**玻璃瓶內，經充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣*好用均質器以8000-10000r/min的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液。
（2）用1ml**吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml**生理鹽水或其他稀釋液的試管內（注意吸管**不要觸及管內稀釋液），振搖試管，混合均勻，做成1：100的稀釋液。
（3）另取1ml**吸管，按上面操作順序，做10遞增稀釋液，如此每增加一次，即換用1支1ml**吸管。
（4）根據樣品衛生標準要求或對樣本污染情況進行估計，選擇2-3個適宜稀釋度，分別在做10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1 ml稀釋液于**平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。
（5）稀釋液移入平皿后，應及時（從檢樣稀釋到傾注平板不超過20min）將涼至46℃左右營養瓊脂培養基注入平皿內15ml，并轉動平皿使混合均勻。同時，將營養瓊脂培養基傾入不加有1ml稀釋液的**平皿內作空白對照。
（6）待瓊脂凝固后，翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養48±2h，。取出計算平板內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數。
    在操作過程中要注意幾個事項：

1.操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全**的。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行**處理。樣品如果有包裝，應用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。操作應當在超凈工作臺或經過**處理的無菌室進行。

2．采樣的代表性：如系固體樣品，取樣時不應集中一點，宜多采幾個部位。固體樣品必須經過均質或研磨，液體樣品須經過振搖，以獲得均勻稀釋液。

3.傾注用培養基應在46℃水浴內保溫，溫度過高會影響菌的生長，過低瓊脂易于凝固而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。

4.傾注培養基的量規定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數觀察。

5.為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應盡快傾注培養基并旋轉混勻，可正反兩個方向旋轉，檢樣從開始稀釋到傾注*后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。

6．為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質與細菌菌落發生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經培養，而于4℃環境中放置，以便計數時作對照觀察。

　   7.在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養后菌落呈紅色，易于分別。
    8.吸管上端要塞上棉花，避免交叉污染；棉花塞得不宜過緊也不能過松。
    9.倒培養基前，瓶口要過火焰。
    10.做空白對照，順便可以鑒定一下你的器皿、培養基以及水是否滅好菌了。
    11.平板一定要倒置放入培養箱里，因為培養箱內環境溫熱，培養基內水份充足，培養過程中會形成水份，蒸發，遇到平板的頂部會凝聚形成水珠，這時如果不倒置，會滴到培養基表面，使瓊脂表面濕潤，細菌就會長“糊”了，從而不利于形成菌落。
    培養完后還要進行菌落計數的報告，這點也很重要，前面的工作做的再好，不會計數或是記得不準確前面的一切都是徒勞。
（1）平板菌落數的選擇
     選取菌落數在30—300之間的平板作為菌落總數測定標準，一個稀釋度使用兩個平板，應采用兩個平板平均數，其中一個平板有較大片狀菌數生長時，則不宜采用，應以無片狀菌數生長的平板柞為該稀釋度的菌落數，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2代表全皿菌落數，平皿內如有鏈狀菌落生長時（菌落之間無明顯界線）若僅有一條鏈，可視為一個菌落，如有不同來源的幾條鏈，則應將每條鏈作為一個菌落計。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數乘2代表全平板的菌落數。當計數平板內的菌落數過多（即所有稀釋度均大于300時），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數。再乘以相應稀釋倍數作為該平板的菌落數。

（2）稀釋度的選擇

1.應選擇平均菌落數在30~300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數報告之（見表1中例1）。

2.若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30~300之間，則視兩者之比如何來決定若其比值小于或等于2，應報告其平均數；若大于2則報告其中較小的數字（見表1中例2及例3）。

3.若所有稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度*高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1中例4）。

4.若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度*低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1中例5）。

5.若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以*低稀釋倍數報告之（見表1中例6）.

6.若所有稀釋度的平均菌落數均不在30~300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以*接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1例7）。

（3）菌落數的報告

     菌落數在100以內時，按其實有數報告；大于100時，采用兩位有效數字，在兩位有效數字后面的數值，以四舍五入的方法計算。為了縮短數字后面的零數，也可用10的指數來表示（見表1）。

微生物檢測的**個重要指標就是大腸菌群的測定，大腸菌群系指一群在37度能發酵乳糖、產酸、產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性的無芽胞桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群系以100mL（g）檢樣內大腸菌群*可能數（MPN）表示。大腸菌群MPN是采用一定的方法，應用統計學的原理所測定和計算出的一種*近似數值。大腸菌群MPN常規的檢驗方法有三管系列、五管系列和其它系列，*常用的是三管系列，也有采用五官系列的，像生活飲用水中總大腸菌群的測定采用的就是五官系列。其原理相同，區別在于接種樣品的稀釋度和各稀釋度的管數，三管系列接種三個稀釋度、每個稀釋度三管、五管系列接種五個稀釋度、每個稀釋度五管。以三管系列較為簡便。

那我們就以三管系列為例說說大腸菌群測定的步驟，其實食品中微生物的檢測首先**步都是要進行檢樣處理，然后根據樣品標準中微生物的限量及污染程度，選擇合適的稀釋度，根據要培養的菌種選擇適宜的培養基及時間、溫度等。前面我們已經講過菌落總數測定的檢樣過程，就不重復了，我們看下面的操作，將處理好的樣品接種于乳糖膽鹽發酵管內，接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發酵管；1m1及1m1以下者，用單料乳糖膽鹽發酵管，每一稀釋度接種3管，置36±1℃溫箱內，培養24±2小時，如所有乳糖膽鹽發酵管均不產氣，則可報告為大腸菌群陰性。如有產氣者，按下列程序進行。

分離培養：將產氣的發酵管分別轉種到伊紅美蘭瓊脂平板上，置36±1℃溫箱內培養18—24小 時，然后取出，觀察菌落形態，并作革蘭氏染色和證實試驗。 

證實試驗：對典型和可疑菌落進行觀察和證實試驗。由于大腸菌群是一群細菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態等方面與大腸菌群的檢出率密切相關。國家標準方法規定伊紅美藍平板為分離培養基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有綠色金屬光澤或無金屬光澤時，檢出率*高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。另外，挑取菌落數與大腸菌群的檢出率有密切關系，只挑取一個菌落，由于機率問題，尤其當菌落不典型時，很難避免假陰性的出現。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應多挑幾個，以免出現假陰性。

將挑取的可疑大腸菌群菌落進行革蘭氏染色。同時接種乳糖發酵管，置36±1℃溫箱內培養24±2小時，觀察產氣情況，凡乳糖發酵管產氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。到這里我們就要了解一下什么是革蘭氏染色？革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過這一染色，可把幾乎所有的細菌分成革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌兩大類，因此它是分類鑒定菌種的重要方法。我們來看看這種方法的步驟：　　細菌先經堿性染料結晶紫溶液初染后，分別染上紫色，而經碘液媒染，結晶紫就與碘分子形成了一個分子量較大的染色較牢固的復合物。接著用95%酒精脫色，在一定條件下有的細菌此色不被脫去，有的可被脫去，脫色后再用一種紅色染料如堿性番紅等進行復染，前者仍帶紫色，后者則被染上紅色。因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G⁺），后者為革蘭氏陰性菌（G^—）。有芽胞的桿菌和絕大多數的球菌，以及所有的放線菌和**都呈革蘭氏陽性反應；弧菌，螺旋體和大多數致病性的無芽胞桿菌都呈現陰性反應。

　　染色反應的主要依據就是革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學組成和生理性質上有很多差別，染色反應不一樣?，F在一般認為革蘭氏陽性菌體內含有特殊的核蛋白質鎂鹽與多糖的復合物，它與碘和結晶紫的復合物結合很牢，不易脫色，陰性菌復合物結合程度底，吸附染料差，易脫色。

　　另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴格控制。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應；PH很低時，則可都呈負反應。此外，兩類菌的細胞壁等對結晶紫—碘復合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應嚴格控制。

　　革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

　　１）涂片干燥固定。涂片不宜過后，以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱否則會改變甚至破壞細胞形態。

　　２）草酸銨結晶紫染1分鐘。

　　３）自來水沖洗。

　　４）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。

　　５）水洗，用吸水紙吸去水分。

　?。叮┘?span lang="EN-US">95%酒精數滴進行脫色，直至流出的乙醇無紫色，立即水洗，吸去水分。結果是否正確，這步是關鍵。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌，脫色時間為20～30秒。

　?。罚┓t染色液（?。┤?span lang="EN-US">1分鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

　　染色的結果，革蘭氏陽性反應菌體都呈紫色，陰性反應菌體都呈紅色。

證實實驗完成后就可以進行報告了，報告：根據證實為大腸菌群陽性的管數，查MPN的檢索表(見表)，報告每100ml(g)大腸菌群的*近似數(MPN)。

表內所列檢樣量如改用10、1、0.1時，則表內數字應相應降低10倍；如改用0. 1、0.01、0.001時，則表內數字應相應增加10倍。

標準中還提到了糞大腸菌群的檢出，它從屬于大腸菌群，我在這里簡單地給大家提一下，用接種環將前面講述的操作中所有產氣的乳糖膽鹽發酵管培養物轉種于EC肉湯中，置44.5±0.2℃水浴箱內培養24±2h,培養后不產氣則報告為陰性；將產氣的EC肉湯管分別轉種于EMB上，培養18～24h，凡平板上有典型菌落者，則證實為糞大腸菌群陽性。報告同上。

 微生物檢驗還有兩個重要指標就是霉菌、酵母的計數及致病菌的檢驗，因為企業的出廠檢驗微生物這塊主要是菌落總數和大腸菌群，所以后兩個指標我就給大家簡單介紹一下，讓大家了解一下。霉菌和酵母的培養可以使用同一種培養基，通過長出的菌落形態特征來判斷計數，霉菌*顯著的特征就是一般有菌絲，不規則無固定大小，*初往往是白色或淺色，當長出孢子后就成好多顏色，像紅色、綠色、黑色等等。而酵母菌一般比較光滑，隆起，多為乳白色，少數有紅色，與細菌菌落特征相似。一般使用的培養基是孟加拉紅，檢樣操作和前面一樣，但是培養霉菌要求稀釋樣品要充分振搖30min以上，還要反復吹吸50次，一是霉菌孢子充分散開。檢樣完畢后選擇合適的稀釋度，取1mL稀釋液加到平板內，加入培養基待凝固后倒置放入25℃～28℃的培養箱內，3天后開始觀察，共培養觀察5天。然后選擇菌落數在10～150之間的進行報數，稀釋度的選擇及菌落的報告方式都可參照菌落總數報出方式。我們再來說說致病菌的檢驗，主要的是三種沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌。我們以沙門氏菌為例簡單的介紹一下操作，致病菌的檢測**步都要進行增菌，將25g樣品加入到225mL緩沖蛋白胨水（BP）中于36℃±1℃培養4h,取10mL加入到100mL四硫酸鈉煌綠增菌液(TTB)內于42℃培養18h～24h,同時，另取10mL于100mL亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液內于36℃±1℃培養18h～24h。分離，取增菌液劃線接種一個亞硫酸鉍（BS）瓊脂和一個HEKTOEN氏腸道菌（HE）瓊脂上，于36℃±1℃培養18h～24h，BS 上培養40～48h。根據沙門氏菌在每種培養基上菌落形態挑取典型的可疑菌落(BS上產硫化氫的菌落呈褐色，灰色或黑色，有時帶有金屬光澤。有些菌株不產生硫化氫，形成灰綠色的菌落，周圍培養基不變；HE上菌落呈蘭綠至蘭色，帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養物可呈現大的光澤黑色中心或幾乎全部黑色的菌落，多數產硫化氫)進行生化試驗接種到三糖鐵上，于36℃±1℃培養18h～24h，通過在TSI內的反應來判定，然后進一步進行血清學的鑒定。

我們都知道微生物的檢測*主要的就是要保證無菌操作，只有這樣才能保證出具數據的真實性和可靠性。下面講的內容就是怎樣做才能保證數據的準確。首先我們來區別兩個概念，**和**這兩個詞在實際使用中常被混用，其實它們的含義是有所不同的。**是指應用**劑等方法殺滅物體表面和內部的病原菌營養體的方法，而**是指用物理和化學方法殺死物體表面和內部的所有微生物，使之呈無菌狀態。從概念中我們就能看出來我們在做微生物的試驗是要進行前期的**工作，而不是簡單的**。我們就來看看通常采用地**方法：　

一、物理方法：有高溫、輻射、超聲波、激光、過濾等等，在實驗室中*常用的就是高溫**和輻射**。

1、高溫

　　利用高溫進行**、**或防腐，是*常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細胞內的蛋白質和酶類發生變性而失活，從而起**作用，不光是高溫可以**，通常低溫也可以起抑菌作用，所以我們可以把預先配好的培養基放到冰箱里進行保存。高溫**包括干熱**法和濕熱**法，在同樣的溫度下，濕熱**的效果比干熱**好，這是因為一方面濕熱易于傳遞熱量，另一方面由于濕熱更易破壞保持蛋白質穩定性的氫鍵結構，從而加速蛋白質變性而迅速死亡。

１）干熱**法:

　　a.灼燒**法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，**迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環、試管口及放培養基的瓶口，檢樣使用的剪子鑷子等。

　　b.干熱空氣**法：即把待**的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160°C，恒溫1小時即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的**。這一般這可以用來烘干滅好菌的平板和吸管。

２）濕熱**法:

多數細菌和**的營養細胞在60℃左右處理5～10分鐘即可殺死，酵母菌和**的孢子稍耐熱些，要用80℃以上處理才能殺死，而細菌的芽孢*耐熱，一般要在120℃下處理15分鐘才能殺死。這就是為什么器皿及蒸餾水的**都要在121℃高壓**15分鐘以上，而一般的培養基**也都采用121℃高壓**15分鐘。濕熱**法包括常壓法和加壓法。

常壓法：

　　a.巴氏**法：有些食物會因高溫破壞營養成分或影響質量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物的營養和風味，又進行了**，保證了食品衛生。該法一般在60～85℃處理15秒至30分鐘既可達到**目的。此法為法國微生物學家巴斯德開創，故名為巴氏**法。

　　b.煮沸**法：直接將要**的物品放入清水中，煮沸數分鐘，即可殺死細菌的全部營養和部分芽孢。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的**。

c.間歇**法：適用于不耐熱培養基的**。具體做法是：將待**的培養基在80～100°C蒸煮15～60分鐘，殺死其中所有微生物的營養細胞。然后置室溫或放入37°C恒溫箱中過夜，誘導殘留的芽孢發芽。第2天再重復上述步驟，三次左右，就可達到**的目的。此法不需加壓**鍋，但操作麻煩，所需時間長。

加壓法：常規加壓**法和連續加壓**法

　  常規 加壓**法：這是發酵工業、醫療保健、食品檢測和微生物學實驗室中*常用的一種**方法。它適用于各種耐熱、體積大的培養基的**，也適用于玻璃器皿、工作服等物品的**。

　　常規加壓蒸汽**是把待**的物品放在一個可密閉的盛有適量水的加壓蒸汽**鍋中，把鍋內的水加熱煮沸，并把其中原有的空氣徹底驅盡后將鍋密封。再繼續加熱就會使其中壓力升高。由于蒸汽壓的上升，從而溫度也隨之提高到100℃以上。在蒸汽壓達到1kg/厘米²時即0.1MPa，加壓蒸汽**鍋內的溫度可達到121°C。在這種情況下，微生物（包括芽孢）在15~20分鐘便會被殺死，而達到**目的。如**的對象是砂土、石蠟油等面積大、含菌多、傳熱差的物品，則應適當延長**時間。

在加壓蒸汽**中，要引起注意的一個問題是，在恒壓之前，一定要排盡**鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對應關系，這樣會大大降低**效果。

2影響加壓蒸汽**的因素

　　a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對高溫的敏感性不同。多數微生物的營養體和病毒在50~65°C，10分鐘就會被殺死；但各種孢子、特別是細菌芽孢*能抗熱，，要在121°C，15分鐘才被殺死。對同種微生物來講，幼齡菌比老齡菌對熱更敏感。

　　b.微生物的數量多少顯然會影響**的效果，數量越多，熱死時間越長。

c.**對象PH的影響 PH6.0～8.0時，微生物較不易死亡；PH＜6.0時，*易引起死亡。

d.**鍋內空氣排除程度的影響 原理是在驅盡鍋內空氣的前提下，通過加熱把密閉鍋內純水蒸汽的壓力升高而使蒸汽溫度相應提高，也就是說是依靠溫度而不是壓力達到**的目的。因此，在一切利用加壓蒸汽**法的場合下，必須做到徹底排除**鍋內的殘余空氣。

e.**對象的體積 **對象體積的大小會影響熱的傳導速率。

3**對培養基成分的影響

    除對培養基中的淀粉成分有促進糊化和水解等少數有利影響外，很多是不利因素：

　　a.pH值改變，普遍下降。

　　b.產生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發生化學反應而產生混濁或沉淀。例如Ca⁺²與PO₄^-3化合，就會產生磷酸鈣沉淀。

　　c.破壞營養，提高色澤，不少培養基顏色加深。

　　d.體積和濃度有所變化，降低濃度氣溫低時會增加冷凝水。

　　可以采用特殊加熱**的方法消除有害影響，像對含有在高溫下易破壞成分的培養基，如含糖組合培養基，可進行低壓**15分鐘，所以像我們培養大腸菌群所用的乳糖膽鹽培養基就是采用了115℃0.07MPa左右**15分鐘。

２、輻射

　　利用輻射進行****，可以避免高溫**或化學藥劑**的缺點，所以應用越來越廣，目前主要應用在以下幾個方面：

　?。保┫裎⑸飳嶒炇?、超凈工作臺都應用紫外燈**。避免紫外燈的照射，打開時人員要離開。

　?。玻┻€有應用β射線作食品表面**，γ射線用于食品內部**。經輻射后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延長。

３、過濾

　　采用機械方法，設計一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過過濾，只讓液體培養基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從而達到**的目的。這種**方法適用于一些對熱不穩定的體積小的液體培養基的**以及氣體的**。它的*大優點是不破壞培養基中各種物質的化學成分。但是比細菌還小的病毒仍然能留在液體培養基內，有時會給實驗帶來一定的麻煩。

二、化學方法

　　一般化學藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微生物，所以是起**劑的作用，而不是**劑。

能迅速殺滅病原微生物的藥物，稱為**劑。能抑制或阻止微生物生長繁殖的藥物，稱為防腐劑。但是一種化學藥物是**還是抑菌，常不易嚴格區分。**劑在低濃度時也能**（如1：1000硫柳汞）。由于**防腐劑沒有選擇性，因此對一切活細胞都有毒性，不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對人體組織細胞也有損傷作用，所以只能用于體表、器械、排泄物和周圍環境的**。常用的化學**劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。像在做試驗時可以用75%的酒精對手進行**。

為了保證滅好菌的器皿和培養基不被污染都要將口包好密封，而且為了避免微生物的滋生和繁殖，做完實驗的器具必須先進行**再洗刷?？傊⑸餀z驗既要保證環境的無菌又要保證操作規范不引入外來菌。

我想在座的各位其中應該有罐頭生產企業，罐頭的微生物檢驗要求商業無菌，那我簡單的介紹一下商業無菌的檢測。首先打開一罐測一下PH值，PH值等于或小于4.6的為酸性罐頭，大于4.6的為低酸性罐頭，然后*少取3罐進行保溫，低酸型于36℃±1℃保溫10天，酸性的于30℃±1℃保溫10天。保溫過程中每天觀察，如有胖聽或泄漏等現象，立即剔出作開罐檢查。胖聽是由于罐頭內微生物活動或化學作用產生氣體，形成正壓，使一端或兩端外凸的現象。泄漏是罐頭密封結構有缺陷，或由于撞擊而破壞密封，或罐壁腐蝕而穿孔致使微生物侵入的現象。開罐檢查包括PH測定，看與開始時有否顯著差異；感官檢查，外觀、色澤、狀態、氣味等進行觀察和嗅聞、用餐具按住食品或戴薄紙套以手指觸感，鑒別是否腐敗變質。對感官或PH檢查結果認為可疑的，進行涂片染色鏡檢。若是出現胖聽、泄漏或開罐檢查發現PH、感官異常、腐敗變質，進一步鏡檢發現有異常，均應及時進行微生物接種培養。

以上就是我對食品中微生物檢測的一些總結和個人的理解和積累，希望對大家有所幫助。謝謝大家！